Diagnostické metody pro stanovení patogenů kulturních rostlin v posledních desetiletích zaznamenaly nevídaný rozvoj a značně rozšířily poznání příčin onemocnění způsobených viry, viroidy, mykoplazmami, bakteriemi i fytopatogenními houbami. Pro stanovení patogenů se kromě sérologických metod v diagnóze uplatňují metody biologické, elektronmikroskopické, chemicko-fyzikální a v poslední době i metody molekulární.
Úvod do historie
První objev protilátek a jejich přípravu zaznamenaly lékařské vědy koncem 19. století. Při studiu rostlinných virů byla poprvé aplikována sérologie Dvorakem (1927), který objevil antigenní vlastnost u mozaikových rostlin bramboru. Důkaz přítomnosti specifického antigenu viru mozaiky tabáku v rostlinách tabáku provedla Bealeova (1928, 1931, 1932). Gratia (1933) dokázal, že rostliny infikované virem mozaiky tabáku nebo virem mozaiky bramboru obsahují specifické antigeny těchto virů. Birkeland (1934) zjistil, že příbuzné kmeny virů obsahují společné antigeny. O další vývoj rostlinné sérologie se zasloužil Matsumoto a Somazava (1932, 1933), Spooner a Bawden (1935), Bawden a Pirie (1936). Chester (1935, 1937), Dunin a Popova (1937, Jermoljev a Hruška 1939) a další badatelé.
Otázkou sérologické příbuznosti virů se zabýval zejména Bercks (1959, 1960, 1963). Chester (1937) shrnul výsledky bádání do roku 1937 ve své práci A critic of plant serology. Další přehledy o použití sérologie při studiu rostlin a jejich patogenů uvádějí např. Schramm (1954), Moritz (1958), Matthews (1957), Slogteren (1957) aj.
Vývoj sérologie spočíval ve zdokonalování metod čistění antigenů, jejich koncentrování, zdokonalování způsobů imunizace zvířat, zavádění adjuvanční techniky imunizace a zjednodušení a zpřesnění metod vzájemné reakce s protilátkami.
K dalšímu rozvoji sérologie přispěli Ouchterlony (1948, 1948, 1958), Oudin (1946, 1952) a Slogteren (1954), jejichž práce se týkaly sérologických metod v gelu. Na základě těchto metod bylo možno studovat jednotlivé složky antigenů a antisér podle počtu a polohy čar precipitace. Zpřesnění v sérologii nastalo zavedením imunoelektroforézy (Gordon et al. 1950), Grabar a Williams (1955). Souběžně byly řešeny teoretické problémy jako tvoření protilátek v imunizovaných zvířatech, podstata imunologických reakcí aj.
Sérologie se stala nedílnou částí teoretických studií o vlastnostech studovaných virů a praktickým pomocníkem při šlechtění. Tak například v bramborářství slouží k ozdravení sadby. V poslední době se též používá ke stanovení odolnosti rostlin vůči virům, bakteriím a houbám.
Metody použité v sérologii patogenů rostlin
Sérologické metody detekce virů jsou založeny na stanovení virových proteinů, při čemž se využívá jejich antigenních vlastností. U připravených protilátek (antisér) je důležitá jejich specifičnost, titr jejich koncentrace a avidita a maximální kapacita precipitace. Snahou při jejich přípravě bylo v první řadě zvýšení jejich titrů, spočívajících ať již v koncentraci antigenních vlastností virů v rostlinné šťávě, vhodný způsob adjuvanční techniky imunizace v jejím eventuálním opakováním nebo v dokonalém vyčištění antisér a jejich izolace. Uvedené metody se neobešly bez použití chemických a imunochemických metod.
Sérologické metody se neustále zdokonalovaly, podle jejich charakteru je možno je rozdělit na sérologické reakce kvalitativní, ke kterým patří reakce precipitace, reakce aglutinace, reakce vazby komplementu, z nefelometrických metod metoda anafylaxe, sérologická metoda neutralizace viru, značení protilátek fluorochromy, použití aktivního uhlí a Sephadexu G 50.
Do sérologických metod kvantitativních patří kvantitativní stanovení antigenů sérologickou metodou, relativně kvantitativní stanovení antigenu viru z množství specifického precipitátu, zjištění největšího zředění šťávy, při kterém ještě nastává pozitivní reakce s homologním antisérem. Do těchto metod je také možno zařadit kvantitativní stanovení virů chromatografickou a nefelometrickou metodou. Ke kvantitativním metodám patří také relativně kvantitativní stanovení bílkovinných antigenů metodou difuze v agaru.
Úplným převratem ve vývoji sérologických metod, použitých ke stanovení rostlinných virů znamenal objev enzymatické imunosorbční analýzy uváděné pod zkráceným anglickým termínem ELISA (Enzyme - linked imunosorbent assay) v roce 1976 Clarkem a Adamsem. Test vyniká vysokou citlivostí a zachytí virus i v nízkých koncentracích. Stanovení viru metodou ELISA se uplatnilo při stanovení virů, viroidů, bakterií a fytopatogenních hub.
Podstata ELISA testu
Vlastní reakce probíhá na antigenním determinantu s protilátkami. Interakce mezi antigenem a protilátkou se účastní vodíkové vazby, solné můstky, elektrostatické náboje a ještě další faktory. Jejich afinita je ovlivněna teplotou, pH a podmínkami rozpouštědla. Při ELISA testu se používají dva typy protilátek a to polyklonální a monoklonální. Výběr protilátek závisí na vybraném typu testu. Reakce antigen - protilátka je stanovena pomocí imunoglobulinu (protilátky) značené enzymem nebo molekuly značené enzymem, která detekuje antivirové imunoglobuliny tzv. konjugát. V rostlinné virologii se ke značení protilátek používá enzym alkalická fosfatáza. Potom se do reakce zapojí substrát specifický pro konjugát a dojde k výslednému zabarvení, které se vyhodnotí spektrofotometricky. Využití ELISA testu se uplatnilo například při zjišťování hybridů meruňky k viru šarky švestky.
Konzervace rostlinného materiálu infikovaného virem a příslušných antisér
Konzervované izoláty virů a antisér jsou nedílnou součástí světových sbírek patogenů, slouží pro jejich snadnou výměnu mezi specializovanými pracovišti, jsou přesně evidovány a jsou uchovány i „vzácné viry“, které byly nalezeny pouze na několika lokalitách a které v budoucnu mohou mít epidemiologický význam. Je možno je použít také po jejich reprodukci na hostitelských rostlinách pro testování odolnosti šlechtitelského materiálu za účelem získání rezistentních odrůd.
Způsob uchování rostlinných virů v pletivech rostlin in vitro byl studován z hlediska jejich udržení bez pasážování na živých rostlinách. Z konzervačních metod byla úspěšně použita dehydratace listů v uzavřených zkumavkách pod chloridem vápenatým. Poprvé ji použil McKinney v roce 1947 a 1953. Hollings a Stone (1969) prokázali, že dehydratované preparáty jako virus mozaiky vojtěšky v. mozaiky okurky, v.mozaiky hrachu , v. nekrózy tabáku, v. bílého jetele si udržely infekčnost až 9 let. Infekčnost virů v dehydratovaných listech prokázali Boss, Nikolic a Stakič (1969).
K technicky náročnějším metodám patří lyofilizace purifikovaných virů. V České republice postupovali touto metodou Albrechtová a spol. (1968) u viru X, M a S bramboru. Chod a Polák (1975) konzervovali virus mozaiky tabáku, v. mozaiky salátu, v. mozaiky okurky, v. žloutenky řepy, v. šarky švestky a v. mozaiky vodnice za velmi nízkých teplot. Virus X, Y a virus mozaiky fazolu konzervovali za použití lyofilizace. Preparáty virů si zachovaly infektivitu a sérologickou aktivitu ještě za 12 měsíců po skladování. Preparát Y viru brambor ztratil infektivitu za šest měsíců po skladování při velmi nízkých teplotách. Výsledky potvrdily vhodnost přidávání peptonu při konzervaci virových antigenů.
Chemické způsoby při použití různých stabilizačních činidel (glycerin) použil již v roce 1950 Bercks u purifikovaných preparátů viru mozaiky okurky. Richter a spol.(1978) použil 2% formaldehyd s následným uložením preparátů při teplotě 5 C. Elektronmikroskopickým vyšetřením nezjistil po třech letech změny v morfologii virionů.
Z fyzikálních metod bylo pro konzervaci virů použito zmražení listů při teplotách –20 C nebo při ultranízkých teplotách v prostředí tekutého dusíku (-196 C).
Ve sbírkách jsou konzervované preparáty virů, bakterií i fytopatogenních hub registrovány a katalogizovány. Katalog sbírky rostlinných virů obsahuje tyto údaje: název viru, jméno autora izolace, místo izolace, taxonomické zařazení viru, popis morfologie virionů, způsob inokulace, název indikátorové rostliny, na kterou se provádí pasážování viru, způsob inokulace např. u viru přenosných vektory doba nabývacího sání, druh vektora. Při mechanické inokulaci se uvádí název inokulačního pufru, jeho pH, způsob konzervace a datum poslední reaktivace.
Ve sbírce virů zelenin se podařilo udržet infekčnost virů ve vysušených listech pod chloridem vápenatým (tzv. dehydratace) v uzavřených skleněných zkumavkách uchovávaných při teplotě 5 C. Jejich reaktivace je periodicky opakována na specifických hostitelských nebo indikátorových rostlinách.
Ve sbírce Výzkumného ústavu rostlinné výroby v Ruzyni jde o virus mozaiky huseníku, virus černé kroužkovitosti rajčete, v. aspermie rajčat, v. mozaiky celeru, v. mozaiky salátu, v. žluté mozaiky vodnice, v. mozaiky okurky, v. obecné mozaiky fazolu a v. žluté mozaiky cukety. Z virů ovocných dřevin jde o virus latentní kroužkovitosti jahodníku, v. latentní kroužkovitosti myrobalánu, v. žlábkovitosit kmenu jabloně, v. chlorotické skvrnitosti jabloně, v. vrásčitosti jabloně a kmen žloutnutí žilek hrušně, v. chlorotické skvrnitosti jabloně. Ve sbírce je uložen také virus šarky švestky, izolát V, izolát slivoňový, izolát Vegama a izolát Nectagrant.
O důležitosti konzervace fytopatogenních organizmů svědčí okolnost, že jejich výzkum byl zařazen do Národního programu genofondu mikroorganizmů a drobných živočichů v České republice. Význam sbírek je také důležitý pro snadnou národní i mezinárodní výměnu konzervovaných preparátů při komparativním studiu patogenů. Konzervované purifikované preparáty nemohou být zaměněny, k čemuž může dojít při pasážování fytopatogenních mikroorganizmů na hostitelských rostlinách.
Konzervované izoláty virů a antisér jsou nedílnou součástí světových sbírek patogenů, slouží pro jejich snadnou výměnu mezi specializovanými pracovišti, jsou přesně evidovány a jsou uchovány i „vzácné viry“, které byly nalezeny pouze na několika lokalitách a které v budoucnu mohou mít epidemiologický význam. Je možno je použít také po jejich reprodukci na hostitelských rostlinách pro testování odolnosti šlechtitelského materiálu za účelem získání rezistentních odrůd.
Vývoj diagnostických metod rostlinných virů a jiných fytopatogenních mikroorganizmů se v současné době nezastavil, výzkum pokračuje dále na rozvoji a praktickém využití molekulárně biologických metod. Diferenciace virů a jejich specifických kmenů značně pokročily. Podařilo se rovněž rozšířit poznatky o vektorech virů. Ochrana proti virům se orientuje především na získání rezistentních odrůd rezistentních rostlin.
