Vaccinium myrtillus L., podľa botanického názvoslovia brusnica čučoriedková, je rozšíreným druhom v horských a podhorských oblastiach severného Slovenska. Brusnica čučoriedková, všeobecne nazývaná čučoriedka, patrí do čeľade brusnicovitých (Vacciniaceae). Je chutným a dieteticky cenným druhom ovocia, ktorého znížená plodivosť nestačí uspokojiť dopyt spotrebiteľov (jej nešetrný zber zároveň devastuje porasty aj v chránených oblastiach).
Alternatívnym druhom, ktorý môže nájsť u nás uplatnenie, je Vaccinium corymbosum L. - brusnica chocholíkatá (Červenka a kol.., 1986) - synonymum záhradná, kanadská, veľkoplodá, pochádzajúca zo Severnej Ameriky. V ostatných rokoch sa tento druh stáva populárny hlavne medzi záhradkármi. Pokusy s jeho pestovaním na lokalite v Krivej na Orave (výskumná stanica VÚTPHP v Banskej Bystrici) poukazujú aj na možnosť plantážnického pestovania.
Založenie produkčných výsadieb a realizácia plantážnického spôsobu pestovania uvedeného druhu závisí od dostatočnej produkcie kvalitného a zdravého výsadbového materiálu. Z uvedeného dôvodu sme v Ústave genetiky a biotechnológií rastlín SAV v Nitre začali v spolupráci s Výskumnou stanicou v Krivej na Orave pokusy s množením vybraných odrôd brusnice chocholíkatej, a to prostredníctvom metód in vitro, ktoré sa v súčasnosti stále viac využívajú na regeneráciu a efektívnu reprodukciu rôznych druhov rastlín. Prednosťou metód in vitro (okrem rýchleho množenia) je možnosť získať z malého množstva východiskového materiálu v relatívne krátkom čase a nezávisle od vegetačného obdobia bezvírusové, geneticky stabilné a uniformné rastliny. K ďalším výhodám patria možnosť dlhodobého uskladnenia a uchovania cenných genotypov v kultúre in vitro (génová banka), ako aj transportovanie týchto kultúr bez zdĺhavých overovaní a pod.
V našich pokusoch sme dosiahli efektívny systém množenia druhu Vaccinium corymbosum L. - brusnice chocholíkatej prostredníctvom kultúry vrcholových alebo pazušných púčikov ako primárnych explantátov, prípadne izolovaných meristémov s jedným alebo dvoma listovými primordiami (metóda priamej regenerácie výhonkov z organizovaných pletív).
Spôsob regenerácie z izolovaného rastového (vegetačného) vrcholu, definovaný ako meristémová kultúra, je z hľadiska možnosti získania bezvírusových rastlín významnejší, ale vzhľadom na potrebu technickej zručnosti pri izolácii meristému (pod lupou) a náročnosti na manipuláciu, metodicky zložitejší. Dôležité je, aby pri manipulácii nedošlo k poškodeniu meristému, ktoré môže viesť k jeho odumretiu. Stupeň prežitia meristémov sa znižuje s jeho zmenšujúcou sa veľkosťou. Kultúra celých púčikov vyžaduje len odstránenie krycích šupín, je nenáročná na manipuláciu a zabezpečuje prevažne bezproblémovú proliferáciu výhonkov.
Na založenie kultúry a odvodenie výhonkov sú vhodné spiace púčiky (odber vo februári a začiatkom marca), ktoré pred umiestnením na živné médium premyjeme pod tečúcou vodou a vysterilizujeme, aby sme ich, v záujme zachovania životaschopnosti, zbavili patogénov. Na sterilizáciu možno použiť rozličné chemické dezinfekčné prostriedky (napr. etanol, chlorid ortuťnatý, chloramín, peroxid vodíka, chlorid vápenatý, chlorid sodný). Na zamedzenie kontaminácie mikroorganizmami je nevyhnutná sterilizácia nielen explantátov, ale aj kultivačného média (v autokláve pri 120 0C a tlaku 125 kPa), nástrojov (v autokláve alebo etanolom a plameňom) a celého prostredia (ultrafialovým žiarením), v ktorom pracujeme. Práce spojené so založením kultúry, ako aj prenos odvodenej kultúry na čerstvé kultivačné médium, sa uskutočňujú v sterilnom boxe.
Výsledný efekt regenerácie rastlín závisí od úspešnosti priebehu jednotlivých etáp procesu mikropropagácie: - izolácie explantátu (púčika alebo izolovaného meristému) s cieľom jeho nekontaminovaného vývinu na kultivačnom živnom médiu, indukcie proliferácie výhonkov a tzv. multiplikácie (tvorby viacvýhonkovej kultúry), izolácie mikrovýhonkov a ich zakorenenia a prenosu zakorenených mikrovýhonkov zo sterilných podmienok in vitro do nesterilných in vivo, aklimatizácie odvodených rastlín a ich adaptácie na pestovanie v podmienkach in vivo.
Takýmto metodickým postupom sme dosiahli úspešnú regeneráciu vybraných odrôd druhu Vaccinium corymbosum L.: ´Berkeley´, ´Blueray´, ´Bluecrop´, ´Darrow´, ´Duke´, pestovaných na lokalite v Krivej na Orave, odkiaľ sme si priniesli vetvičky so spiacimi púčikmi. Segmenty stoniek s vrcholovými a pazušnými púčikmi sme vysterilizovali (70% etylalkoholom 1 - 2 min. a 0,1% HgCl2 6 min.) a následne izolované púčiky alebo meristémy sme umiestnili na kultivačné médium (podľa Andersona - 1980) s obsahom makro- a mikroelementov a vitamínov. Do uvedeného základného média sme pridali sacharózu (20 g.l-1) a spevnili ho agarom (6 - 8 g.l-1). Za účelom indukcie a stimulácie proliferácie výhonkov pri testovaných odrodách, sme do základného kultivačného média pridali aj rastové látky - cytokinín zeatín (0,5 – 1,0-2 mg.l-1) alebo 2iP (10,0 - 15,0 - 20,0 mg.l-1) (2iP - 6-- (dimethylallyamino-purin), prípadne v kombinácii s nízkou koncentráciou auxínu IBA (0,1 mg.l-1) (IBA - kyselina -indolyl--maslová). Pre danú odrodu je dôležité exprimentálne overiť a stanoviť optimálnu koncentráciu rastových látok. Nakoľko typ a koncentrácia rastových látok a ich interakcie významne regulujú morfogénne procesy v kultúre in vitro a ovplyňujú vývin a rast odvodenej výhonkovej kultúry (samozrejme na pozadí endogénneho obsahu fytohormónov v danom pletive), výsledok experimentu od nich značne závisí. Dôležitá je aj hodnota pH kultivačného média, ktorú, vzhľadom na kyslomilnosť uvedeného druhu, je potrebné upraviť na 4,5 - 5,0.
Po 4 - 5 týždňoch kultivácie explantátov sme zhodnotili ich reakciu a posúdili regeneračnú schopnosť jednotlivých odrôd na základe počtu explantátov (s diferencovanými výhonkami), počtu výhonkov na primárny explantát, dĺžky výhonkov, ako aj počtu segmentov na výhonok. Segmentáciou výhonkov (na jednonodálne segmenty) môžeme zvýšiť koeficient množenia, čo je, z hľadiska produkcie, dôležité pre komerčné ciele. Na základe uvedených údajov sme, za stanovených podmienok kultivácie, dosiahli obraz o schopnosti regenerácie jednotlivých odrôd. Zistili sme rozdiely v regenerácii jednotlivých odrôd, a to nielen v schopnosti indukcie diferenciácie výhonkov, ale aj v intenzite ich proliferácie. Najlepšiu regeneračnú schopnosť, podľa priemerného počtu výhonkov na explantát, sme dosiahli pri odrode ´Duke´ (5,28 a v ďalších pokusoch 6,3) na médiu s 2 mg.l-1 zeatínu. Podobnú regeneračnú schopnosť preukázali odrody ´Bluecrop´ (priemerný počet výhonkov na explantát 3,9) a ´Berkeley´ (3,8) taktiež na uvedenom médiu. Multiplikačný efekt pri testovaných odrodách sme posudzovali aj štatistickou metódou viacnásobného triedenia počtu výhonkov na explantát. Najnižší multiplikačný efekt sme zaznamenali pri odrode ´Blueray´, a to ako na médiu s 2iP, tak aj s obsahom zeatínu. Pri tejto odrode najvyššie percentuálne zastúpenie tvorili 1 a 2 - výhonkové kultúry, kým pri ostatných odrodách prevládal stredný počet výhonkov (4 - 6) na explantát. V nízkom percentuálnom zastúpení sa vyskytlo 7 a viac výhonkov na explantát, zvlášť pri odrode ´Duke´. Pri odrode ´Blueray´, ktorá vykazovala najnižšiu proliferáciu výhonkov, sme pozorovali najintenzívnejší predlžovací rast. Podobný korelačný vzťah sme zaznamenali aj pri ostatných odrodách. Priemerná dĺžka výhonkov so zvyšovaním multiplikačného efektu (nárast počtu mikrorozmnožených výhonkov) klesala.
Výsledky experimentov potvrdili závislosť regenerácie odrôd od podmienok kultivácie, zvlášť zloženia kultivačného média (typ a koncentrácia rastových látok), ktoré môže pozitívne, ale aj negatívne ovplyvniť proliferáciu výhonkov a produkciu rastlín. Zeatín pôsobil celkovo účinnejšie na proliferáciu výhonkov ako 2iP. V ďalších pokusoch sa budeme zameriavať na optimalizáciu koncentrácie cytokinínu 2iP pre účely mikrorozmnožovania, nakoľko je z finančného hľadiska prijateľnejší. Pokusy zamerané na priamu regeneráciu rastlín z pletív listov výhonkov, odvodených v kultúre in vitro, poukazujú na možnosť docieliť efektívne množenie aj touto, menej uplatňovanou metódou in vitro. Z pletiva jedného listu možno získať veľký počet rastlín.
Dôležitou etapou mikrorozmnožovania, zvlášť z praktického hľadiska, je indukcia tvorby koreňov. Pokusy so zakoreňovaním v podmienkach in vitro (na kultivačnom médiu s obsahom rôznych koncentrácií auxínu IBA) zatiaľ nie sú dostatočne efektívne. Úspešné zakorenenie izolovaných mikrovýhonkov (80 - 90%) sme, po ich prenose z podmienok in vitro do in vivo, dosiahli priamo v rašeline. Adaptácia rastlín na podmienky in vivo je po prenose bezproblémová. Ich ďalší vývin a rast bude, z hľadiska realizácie väčších výsadieb, dôležitým faktorom perspektívnosti mikrorozmnožovania.
