V minulém článku byly velmi stručně nastíněny metody in vitro, které se aplikují při množení trvalek. Dalším využitím této techniky je šlechtění okrasných rostlin, zejména květin. Hlavním přínosem je především překonání různých fyziologických zábran souvisejících s nekřižitelností rostlin (problémy s opylením a oplozením; umožňuje mezirodové i některé mezidruhové křížení, které by běžně nebylo možné).
Se zrychlujícím se životním stylem lidí je také vyvíjen velký ekonomický tlak na urychlení některých šlechtitelských procesů. Současným podmínkám „nahrává“ právě šlechtění in vitro (ve skle). Ne, že by se celý proces obešel bez standardních šlechtitelských technik, ale právě dopěstování, případně následné došlechtění, a testování rostlin je velmi důležité v běžných podmínkách, kde se teprve ukáže, zda laboratorní technika funguje dle předpokladů.
Současným trendem novošlechtění je vytvořit sortiment květin dostatečně odolný (nejlépe rezistentní) vůči patogenům. Komu by se nelíbilo získat květiny, které by netrpěly na své „tradiční choroby a škůdce“ a nevyžadovaly by chemické ošetření?
Hlavní techniky
Překonání nekřižitelnosti
Jedná se o celkem jednoduchou metodu, při které dopěstujeme prašníky a pestíky ve sterilních podmínkách, ve kterých provedeme také umělé opylení na zakrácenou čnělku (vyhneme se inhibičním účinkům blizny na klíčení pylových zrn), případně přímé oplození vajíčka. Z oplozeného vajíčka pak vzniká zygota, která následně vyklíčí a dá vzniknout novému kříženci. Takovýmto způsobem samozřejmě „obejdeme“ pouze fyziologické bloky křížení, nikoliv genetické.
Indukce polyploidů
Polyploidní rostliny jsou takové, které mají několikanásobně vyšší počet chromozomálních sad než je u daného druhu obvyklé. Jedná se o tetraploidy, hexaploidy, oktoploidy, atd. Výhodou této techniky je zvýšení genetické variability a často dochází i k pozitivním strukturálním změnám rostlinných buněk. Polyploidní rostliny mají větší buňky, vyšší obsah chlorofylu (s tím je spojená intenzivnější fotosyntéza) a často se u nich zvyšuje i obsah některých látek (např. barviva – flavonoidy, antokyany). Rostliny jsou celkově robustnější a často vykazují i vyšší přizpůsobivost vůči prostředí. Problémy mívají s křehčími pletivy, případně se snižující se schopností generativního rozmnožování.
Indukovat polyploidní rostliny lze za pomoci chemických látek i v běžných podmínkách. Kultury in vitro jsou však v tomto případě využitelnější z důvodu lepšího řízeného ovlivnění rostlin mutageními látkami (kolchicin, oryzalin). Tím je možné rostlinná pletiva velmi dobře směřovat k určenému cíli, tzn. k získání geneticky odlišných jedinců.
Tvorba polyploidů je v zahradnickém oboru velmi častá. Tímto způsobem vznikají obsáhlé sortimenty především u cibulovin (Lilium, Narcissus, Tulipa, …), letniček a dvouletek (Callistephus chinensis, Pelargonium zonale, Phlox drummondii, Viola x witrockiana, …).
Indukce haploidů
Cílem je získání haploidních buněk (s polovičním počtem chromozómů) a následně homozygotních rostlin z nezralých pylových zrn nebo z vajíček. Proces je trochu náročnější ohledně nalezení správné koncentrace chemických látek v médiu při iniciaci. Velkou výhodou je však rychlé získání homozygotních rostlin (během 1 – 2 let) určených pro křížení v běžných podmínkách.
Postup získání homozygotů z pylových zrn je následující:
– odběr poupat (nutné zjistit optimální stadium),
– sterilizace a kultivace prašníků (teplota zpočátku vyšší 28 – 32 °C, 1 – 5 dní),
– získání somatických embryí nebo kalusu (haploidní pletiva – poloviční sada chromozómů),
– dopěstování standardním postupem,
– aplikace mutagenů z důvodu zdvojení chormozomální sady a tím i získání homozygotů (kolchicin, oryzalin, aj.).
Tato technika se v zahradnické praxi využívá především u většiny cibulovin (Lilium, Tulipa, …) a některých významnějších květin (Asparagus, Petunia, Saintpaulia, …).
Přenos konkrétního genu do rostliny (transfer genů)
Tato laboratorní technika je z hlediska manipulace s rostlinným genem na in vitro kulturách úzce závislá. Využívá se v případě, kdy je nutné vnést do geonomu rostliny (genetické výbavě) vlastnost, kterou nemůžeme získat z jiných příbuzných druhů. Prakticky řečeno, neexistuje křižitelná rostlina daného druhu, která by měla námi požadovanou vlastnost. Jedná se např. o rezistenci vůči patogenům, kdy využijeme úplně jiný rod rostlin. Transfer, neboli přenos genu se odehrává za velmi specifických laboratorních podmínek, o nichž bychom mohli popsat mnoho stránek. Je to poměrně složitá a velmi nákladná záležitost, která se u květin provádí jen velmi zřídka. Např. přenos genu pro tvorbu modrého barviva (antokyanu) z kosatce (Iris) do genomu hledíku (Antirrhinum majus).
Kultury používané při šlechtění
Explantátové
Při této kultuře se ke šlechtění používají diferencované části rostlin (stonek, listy, kořeny, květy,…). Jde např. o výše uvedený způsob překonání někřižitelnosti, příp. navození polyploidie. Je to základní mechanismus in vitro kultur, bez kterého se nikdy neobejdeme. Dopěstovat části, případně kompletní rostliny potřebujeme vždy.
Somatických embryí
Indukce tzv. somatických embryí je ve šlechtění velmi atraktivní nástroj pro získání velkého množství jedinců, z nichž každý vzniká na počátku pouze z jediné buňky. Za určitých okolností jsou rostlinná pletiva schopna tvořit tato embrya z běžných kalusových (nediferencovaných) buněk. Nejedná se o embryo vzniklé oplozením vajíčka, ale je to velmi podobný útvar vykazující naprosto stejné znaky, jako standardní embryo vzniklé z pohlavního rozmnožování. Často vznikající chimerické pletivo (více typů geneticky odlišných buněk pohromadě v jedné rostlině) vzrostného vrcholu, které se běžně diferencuje z mnoho buněk, způsobuje u kultur in vitro velký problém. Výhodou rostlin vzniklých z embryí je jistota uniformity všech nových buněk. Po obalení somatického embrya speciálními látkami (vznik tzv. umělého semene) s ním můžeme zacházet jako z běžným osivem.
Touto cestou se podařilo indukovat embrya u rodu Agapanthus, Allium, Alstroemeria, Asparagus, Corydalis, Cymbidium, Dianthus, Digitalis, Gladiolus, Helianthus, Ipomoea, Iris, Lilium, Phlox, Primula, Rosa, Solanum a řady dalších.
Kalusové
Využití kalusu (nediferencovaného pletiva) ve šlechtění je velmi jednoduché. Pokud chceme ovlivnit (např. chemickými látkami) genetickou informaci, je k tomu nejlepší použít právě kalus, z nějž vznikne velké množství nových prýtů (výhonů). Proti diferencovaným pletivům je kalus na aplikaci různých látek citlivější, proto se koncentrace aplikovaných látek musí několikanásobně snížit. Nevýhodou těchto kultur je vznik geneticky nestabilních pletiv a prorůstání chimerických výhonů, pocházejících z různorodé skupiny buněk (viz. srovnání se somatickými embryi).
Suspenzní
Asi nejlépe propracovanou a zároveň nejcitlivější kulturou jsou právě suspenze jednotlivých buněk či jejich shluky. Je to extrémní případ kalusové kultury, kdy kultivujeme jednotlivé buňky v tekutém médiu (bez přídavku ztužovadla – Agaru). Složení média je velmi podobné médiu pro kalusové kultury. Většinou je nutno přidat fytohormony (auxiny i cytokininy). Kvůli provzdušňování média je nutné suspenzí neustále třepat, či jinak provzdušňovat. Výhodou kultury je právě množství odděleně fungujících buněk. Z každé z nich může po řízené mutagenezi (záměrná změna genetické informace) vyrůst geneticky odlišný jedinec. Jinak je však tato metoda náročnější, protože samostatné buňky jsou choulostivější a také každý druh rostlin na ni reaguje úplně jinak.
Suspenzní kultury se také často využívají k fúzi (splynutí) protoplastů (rostlinných buněk bez buněčných stěn), tzn. propojení dvou i více buněk do jedné, čímž dochází ke vzniku nových kříženců.
Suspenze buněk se využívají u velké řady rodů, např.: Achillea, Ajuga, Allium, Alstroemeria, Calendula, Chrysanthemum, Cleome, Coleus, Corydalis, Cymbidium, Dendrobium, Echinacea, Euphorbia, Festuca, Gladiolus, Lilium, Linum, Nicotiana, Papaver, Platycodon, Rudbeckia, Solanum, Tagetes.
