Šlechtění na odolnost vůči chorobám má dlouhodobý charakter a vzhledem k časové náročnosti šlechtitelské práce u ovocných dřevin mohou molekulárně genetické metody tento proces výrazně urychlit a usnadnit výběr perspektivních novošlechtění. Rezistentní či tolerantní odrůdy mají široké uplatnění i v konvenčních výsadbách, kde díky menšímu počtu postřiků šetří výdaje na chemickou ochranu a zároveň snižují množství reziduí v plodech. Cílem příspěvku je informovat o výsledcích počátečních pokusů s využitím molekulárních markerů při selekci semenáčků jabloní rezistentních vůči strupovitosti.
Z více než 20 druhů rodu Malus a jejich hybridů vyznačujících se rezistencí ke strupovitosti bylo doposud identifikováno šest různých genů podmiňujících tuto vlastnost. Bohužel, vznik nových ras patogena měl za následek vyřazení některých těchto zdrojů ze šlechtitelských programů. Ke snížení rizika překonání odolnosti ke strupovitosti rozšířením nových ras patogena může významně přispět kumulace dvou různých genů rezistence do nových genotypů.
Nejvýznamnějším nositelem genu monogenní rezistence je planá forma Malus floribunda – klon 821 nesoucí gen Vf podmiňující odolnost proti všem dříve známým rasám strupovitosti. Většina současných šlechtitelských programů u jabloní se zabývá přenosem tohoto genu do genomů moderních kultivarů. Naproti tomu další gen Vm je u odrůd běžně pěstovaných v Evropě zastoupený minimálně. Jeho nositelem jsou botanické druhy M. atrosanguinea a M. micromalus. Mezi další méně využívané geny patří např. Vr z M. pumila, Vbj z M. baccata var. jackii a původní odrůda ´Antonovka´, nesoucí gen Va.
Nejčastějším způsobem zjišťování odolnosti je inokulace semenáčů získaných z křížení vybraných odrůd a genotypů a následné bonitace. Alternativním způsobem ke klasickým metodám zjišťování rezistence je použití molekulárních markerů. Selekce na základě využití markerů je oproti selekci na základě inokulace patogenem finančně náročná, ale nabízí jednoznačné výsledky. Umožňuje navíc detekci kumulace různých genů odolnosti či dominantně homozygotních jedinců, které nelze běžnými technikami výběru zjistit.
Cíle projektu
Výzkum se uskutečnil v letech 2000 až 2004 na České zemědělské univerzitě v Praze, v rámci spolupráce Katedry zahradnictví a krajinářské architektury s Katedrou genetiky a šlechtění a VŠÚO v Holovousích. Prvním cílem byla optimalizace postupů při získání rostlinného materiálu a optimalizace izolace DNA, dále ověření metodického postupu umožňujícího identifikaci genů rezistence na základě v literatuře uvedených specifických markerů a zjednodušení selekce genotypů jabloní s vysokou odolností proti strupovitosti (Venturia inaequalis). Vybrané markery byly následně využity k selekci juvenilních rostlin – semenáčků jabloní z hybridních kombinací nesoucích různé geny resistence.
Vlastní pokusy – křížení jednotlivých odrůd, inokulace patogenem, hodnocení stupně napadení strupovitostí, probíhaly ve VŠÚO Holovousy, s.r.o. Odtud také pocházely všechny vzorky z hybridních kombinací. Technické části – izolace, purifikace a amplifikace DNA, separace agarózovou elektroforézou, byly zpracovány v laboratoři genetických analýz KGŠ. DNA byla z počátku izolována dle upravené metody podle Saghai-Marof (1984) později pomocí soupravy Sigma GenElute Plant Genomic DNA KIT (Sigma, Německo). Izolovaná DNA byla kvantifikována UV spektrometrickou metodou na přístroji Gene Quant RNA/DNA Calculator (Pharmacia Biotech, Velká Británie). Vysokomolekularita byla ověřena elektroforetickou separací. Pro detekci genů rezistence Vf byly použity dominantní specifické primery: U1400F-U1400R dle Gianfranceshi et al., (1996), S51400F-S51400R dle Hemmat et al. (1998), AL07F-AL07R dle Tartarini et al. (1999) a kodominantní primer AM19F dle Tartarini et al. (1999), složení PCR reakce bylo optimalizováno pro podmínky laboratoře (Vejl et al., 2003). Pro detekci genu Vm sloužil dominantní primer P600F-P600R dle Cheng et al. (1998), pro podmínky laboratoře upraveno dle Melounová et al. (2004). Vybrané markery byly vyzkoušeny na základním modelovém souboru rezistentních a citlivých odrůd našeho i zahraničního původu, který sloužil k ověření metodického postupu a výběru nejvhodnějších primerů pro následné pokusy.
Analýza hybridních potomstev z křížení
U hodnocených potomstev byly použity jako rodiče odrůdy ´Resista´, ´Topaz´, ´Rajka´ a ´Retina´ nesoucí gen Vf, dále hybrid OR-45T-132 nesoucí gen Vm, a posléze odrůda ´Angold´ a hybrid HL 665 (´Spartan´ x ´Antonovka´), kteří jsou nositeli genu Va. Hodnoceno bylo 11 kombinačních křížení (tab.1), přičemž u kombinace odrůdy ´Resista´ a OR-45T-132 se jednalo o křížení reciproční. Hodnocen byl různý počet vzorků (dle počtu získaných semenáčů) v rozmezí 20 až 100 vzorků. Po předselekci pomocí inokulačního testu, kdy se vyřadily citlivé genotypy s projevy strupovitosti, byly ostatní semenáčky dále dopěstovány ve skleníku. Pomocí molekulárně genetické detekce dominantní alely Vm genu (Melounová et al., 2004) byly identifikovány rezistentní genotypy. Při použití kodominantního markeru pro Vf gen (Tartarini et al., 1999) byla detekována dominantní Vf i recesivní vf alela tohoto genu. Na obr. 1 je ukázka výsledného elektroforeogramu pro detekci Vf genu. V době hodnocení nebyl znám vhodný primer k detekci genu Va.
Vyhodnocení přítomnosti genu Vf
Na přítomnost genu Vf byl hodnocen soubor 83 odrůd a hybridů vybraných na základě listiny doporučených odrůd. Dominantní alela Vf genu byla detekována u těchto českých odrůd a hybridů: ´Aneta´, ´Biogolden´, ´Dolores´, ´Goldstar´, HL 799, HL 801, ´Karmína´, ´Vysočina´, ´Melodie´, ´Nela´, ´Otava´, ´Rajka´, ´Resista´, ´Rosana´, ´Rubinola´, ´Selena´, ´Topaz´ a ´Vanda´.
Segregace genů v F1 generaci – Analýza semenáčků potvrdila, že v některých letech nedošlo při inokulačních testech k dostatečnému infekčnímu tlaku, který by vyloučil senzitivní genotypy. Z tohoto důvodu bylo v některých případech ponecháno až 90 % semenáčků dané varianty a při hodnocení pak bylo i více než 50 % genotypů homozygotně recesivních.
Procentuální četnosti výskytu Vf genu odolnosti u jednotlivých kombinací je uveden v grafu 1. V křížení ´Retina´ x ´Topaz´, ´Resista´ x ´Topaz´ a ´Resista´ x ´Rajka´ nesli gen rezistence Vf v heterozygotní sestavě Vfvf oba rodiče. Výskyt dominantně homozygotní sestavy Vf Vf byl potvrzen u kombinací ´Resista´ x ´Topaz´ (10 %) a ´Retina´ x ´Topaz´ (5 %). Heterozygotní sestava Vf vf byla detekována u jednotlivých variant u 25 – 92 % hybridů. Recesivně homozygotní sestavu genu vfvf mělo 8 – 70 % hybridů. U kombinací genu Vf a Va se vyskytovala heterozygotní sestava Vfvf u 45 – 60 % hybridů, u recesivně homozygotních vfvf může být rezistence nesena genem Va, který v době pokusů nebylo možné detekovat.
U většiny hybridních kombinací genů Vf a Vm byla prokázána kumulace těchto genů a to u 15 až 28 %. U kombinace OR 45T 132 x ´Retina´ nebyl nalezen žádný genotyp kumulující geny Vf a Vm. Největší počet rezistentních genotypů byl u kombinace ´Resista´ x OR45T132 – Vfvf 54 % a Vmvm 60 %, přitom u 28 % hybridů byl kumulován geny Vf a Vm.
Optimalizace molekulárních markerů
Výsledky zde prezentované jsou z prvních pokusů provedených na ČZU, které sloužily především k optimalizaci jednotlivých kroků aplikace molekulárních markerů a jejich následnému využití při selekci nadějných hybridů. Pokusy byly prováděny s markery majorgenů Vf a Vm rezistence vůči strupovitosti. Vysoký výskyt recesivních homozygotů u řady kombinací potvrdil častou nízkou účinnost inokulačního testu, který neumožnil vyloučit všechny senzitivní genotypy. U jednotlivých genotypů byla určena alelická sestava Vf genu a u dvou kombinací byl potvrzen výskyt dominantních homozygotů s genem Vf.. Výhodou použití molekulárních markerů je taktéž detekce kumulace různých majorgenů, které při inokulaci nelze určit. Kumulace markerů genů Vf a Vm, byla potvrzena u třech ze čtyř kombinačních křížení.
Výzkum byl řešen v rámci projektu č. 1049 NAZV ČR – Komplexní rezistence proti chorobám u jabloní (2001 – 2004).
Pro přidávání komentářů se musíte nejdříve přihlásit.
dear sir/ madam
I have tried to find this paper in English it is about detecting gene related
with resistance in apples
I would be very grateful if you could connect me with the author
or send me his email address
yours faithfully
Omar Ebshish