Kryoprezervace genetických zdrojů rostlin je metoda dlouhodobého uchování rostlinného materiálu v geneticky stabilním a vitálním stavu při ultra-nízké teplotě. Její využití je efektivní zejména u vegetativně množených druhů rostlin, jako jsou například ovocné plodiny a vinná réva.
Nevýhodou vegetativně množených druhů rostlin je skutečnost, že uchování genetických zdrojů těchto plodin není možné ve formě semen a to i v případě, že tyto rostliny semena tvoří. Příčinou je především tzv. heterozygotnost odrůd, která se projevuje tím, že semenné potomstvo obsahuje odlišnou genetickou informaci než matečná rostlina. Proto se tyto plodiny množí klonově – řízky, odkopky, oddenky, hlízami, cibulemi apod. Uchování jednotlivých genotypů je proto možné pouze vegetativní cestou – rostlinami nebo jejich vegetativními zásobními orgány. Vegetativní zásobní orgány mají omezenou dobu skladovatelnosti (obvykle ne déle než jeden rok) a uchovávání rostlin ve vegetativním stadiu s sebou přináší nároky na jejich ošetřování. Rostliny jsou navíc vystaveny vlivu počasí a působení chorob a škůdců, včetně karanténních. Vliv rizikových činitelů lze omezit pěstováním rostlinných explantátů v aseptických podmínkách. Tím lze eliminovat působení chorob a škůdců, ale stále je nezbytné rostliny přesazovat v intervalu minimálně jednoho až dvou let. Řešení tohoto problému přináší metoda kryoprezervace, která umožňuje uchovávat vegetativní části rostlin po desítky let beze změn, čímž dokonce překovává v některých ohledech i uchování rostlin semeny.
Princip kryoprezervace
Se snižující se teplotou se snižuje metabolismus živých organismů. V přirozených podmínkách je omezena aktivita jedince, ale metabolismus na velmi nízké úrovni pokračuje. To souvisí s tím, že i při záporných teplotách se obsah buňky stále nachází v tekutém stavu, i když jsou v mezibuněčných prostorech krystaly ledu. Metoda kryoprezervace jde však dále. Při dalším poklesu teploty dojde k přechodu veškerých buněčných roztoků do pevného stavu. Pohyb molekul je v pevné látce výrazně omezen, a proto lze ve srovnání s kapalnými buněčnými roztoky hovořit prakticky o zastavení veškerých dějů. Má-li kryoprezervace účelně fungovat, musí umožnit jedince nejen dlouhodobě uchovat, ale hlavně jej zregenerovat živého po jeho ohřevu do normální růstové teploty. To znamená, že při kryoprezervaci nesmí v důsledku mrazu dojít k vážnému poškození rostlin, které je obvykle způsobeno tvorbou a růstem ledových krystalů a to hlavně těch, které jsou lokalizovány uvnitř buněk. Má-li být protoplast v pevném stavu a zároveň ne ve stavu krystalickém, musí se nacházet ve stavu amorfním (skelném), který zachovává strukturu blízkou původnímu protoplastu. Amorfní stav je základní podmínkou bezpečného uchování rostlin při ultra-nízkých teplotách a umožňuje využít metodu kryoprezervace i u těch rostlin, které nejsou v přirozených podmínkách schopny překonat působení mrazu.
Jak dosáhnout skelného stavu
Skelný stav lze dosáhnout především omezením obsahu vody v rostlinách a také rychlostí chlazení rostlin. Snižování obsahu vody má však své hranice dané rostlinným druhem či odrůdou. Při příliš silném vysušení sice nedojde ke krystalizaci vody a poškození mrazem, ale rostlinu není možné zregenerovat, protože byla poškozena přílišným vysušením. Existují tři základní způsoby dehydratace rostlinných částí:
● Rostlinný materiál je možné dehydratovat pomocí mrazu, kdy rostoucí krystaly v mezibuněčných prostorech dehydratují okolní buňky,
● rostliny lze dehydratovat rovněž působením silných osmoticky aktivních roztoků, které odvodní protoplasty buněk,
● rostlinné části lze dehydratovat i působením suchého vzduchu, který absorbuje vlhkost rostlinných vzorků.
Za optimálních podmínek je rostlinný materiál po dosažení skelného stavu bezpečně uchován bez významných změn po mnoho let.
Kryoprezervace ovocných plodin
U ovocných plodin existují dva základní metodické přístupy kryoprezervace: kryoprezervace dormantních pupenů a kryoprezervace meristémů tkáňových kultur v podmínkách in vitro. První metoda je jednodušší, ale výsledky zatím nejsou zcela reprodukovatelné. Při aplikaci této metody se použijí části větviček s dormantními pupeny. Ty se mrazem dehydratují a pak ukládají do tekutého dusíku. Po odtání se pupeny naočkují na vhodné podnože, kde zregenerují. Druhá metoda kryoprezervace ovocných dřevin je založena na pěstování tkáňových kultur v aseptických podmínkách. Explantáty se otužují nízkou teplotou a izolují se z nich vzrostné vrcholy s meristémem, které se obalí alginátem podobně jako v případě tzv. umělých semen. Meristémy se vloží do roztoku alginátu sodného a po kapkách obsahujících jeden meristém se kapou do roztoku chloridu vápenatého. Vápník způsobuje polymeraci alginátu. Tím se vytvoří pevná struktura, která obaluje a chrání meristém. Alginátové kuličky s meristémy se suší v proudu sterilního vzduchu v laminárním boxu a pak se uloží do tekutého dusíku. Po ohřevu vzorků do laboratorní teploty probíhá regenerace rostlin na mediu s auxinem, cytokininem a giberelinem. Vzájemný poměr těchto fytohormonů je rozhodující pro regeneraci rostlin a je druhově a někdy dokonce genotypově specifický.
Kryoprezervace révy vinné
Zatímco postup kryoprezervace ovocných dřevin byl odzkoušen a aplikován u nás i v zahraničí, v případě vinné révy se kryoprezervace teprve zkouší s různými výsledky. Úspěšné byly pokusy především s buněčnými kulturami, zatímco s kryoprezervací meristémů, které jsou z hlediska uchování genetické stability nejvýhodnější, jsou zatím potíže. Důvodem může být souvislost mezi mrazuvzdorností a kryoprezervací, kdy mrazu odolávají jen vyzrálé výhony a ne zelené letorosty. Proto je postup kryoprezervace vinné révy ve stádiu výzkumu, kdy se ověřuje, jak reagují tkáňové kultury na otužování nízkou teplotou a osmotickými roztoky.
Využití metody kryoprezervace
Specializované pracoviště ve VÚRV, v. v. i. v Praze se dlouhodobě zabývá problematikou kryoprezervace vegetativně množených plodin. Proto zde byla před několika lety založena Kryobanka vegetativně množených plodin v České republice ve spolupráci se specializovanými plodinovými ústavy, které jsou kurátory jednotlivých plodin jako např. VŠÚO Holovousy, s. r. o., (ovocné plodiny), VÚB Havlíčkův Brod, s. r. o., (brambor), CHI Žatec, s. r. o., (chmel), či VSV Karlštejn (vinná réva). Pracoviště udržuje rovněž těsné vtahy s podobně zaměřenými pracovišti v Evropě i ve světě a v rámci evropské unie funguje jako školící pracoviště pro analýzu kryoprezervovaných vzorků pomocí metod termické analýzy. Využití metod kryoprezervace je na vzestupu u nás i v zahraničí a souvisí se stupněm poznání. Aplikace těchto metod je ekonomicky výhodné zejména z dlouhodobého hlediska. Nejvyšší jsou náklady na uložení vzorků do tekutého dusíku a samotné uchování je relativně levné. Z toho plyne, že pro krátkodobé uložení vzorků s potřebou dostupnosti materiálu jsou vhodné jiné metody, jako např. tkáňové kultury a naopak pro dlouhodobé uložení je vhodná metoda kryoprezervace. V praxi je situace taková, že kryoprezervace je doplňkovou metodou ke stávající metodě uchování genetických zdrojů rostlin a to především těch nejcennějších genetických materiálů.
