V práci je hodnocen účinek metody chemoterapie za použití různých koncentrací ribavirinu k ozdravení rostlin odrůd meruňky a broskvoně od hospodářsky významných virů, a to: viru chlorotické skvrnitosti jabloně (ACLSV), viru nekrotické kroužkovitosti třešně (PNRSV), viru zakrslosti slivoně (PDV) a viru šarky švestky (PPV). Jak vyplývá z výsledků, použití ribavirinu v koncentracích 20 mg/l a 40 mg/l vede k odstranění výše uvedených virů. Použití ribavirinu lze tedy doporučit jako metodu vhodnou k ozdravování rostlin odrůd meruňky a broskvoně od hospodářsky významných virů.
Virová onemocnění způsobují u trvalých kultur, jako jsou broskvoně a meruňky každoročně významné hospodářské škody. Jednou z vlastností virových onemocnění je, že infikované rostliny obvykle nemají k dispozici vlastní účinný aparát pro jejich eliminaci. Bez vnějšího zásahu tak vir v rostlině zůstává po zbytek jejího života. Potřeba rostlin prostých hospodářsky významných virů pro výsadby je však evidentní. Jednou z metod ozdravování kandidátních rostlin je chemoterapie. Metoda chemoterapie využívá působení chemické látky zabraňující množení viru. Tato látka je přidána do kultivačního média při pěstování rostlin v podmínkách invitro. Z ošetřené rostliny je následně odebrán vrcholový segment velký 3 až 5 mm a kultivován v rostlinu, která je testována na přítomnost virů. V předkládané práci jsou představeny výsledky eliminace vybraných virů metodou chemoterapie za použití virostatika ribavirin (1-β-ribofuranosyl-1, 2, 4-triazol-3- carboxamid), používaného k léčbě virových onemocnění v humánní medicíně. Chemoterapie je dosud málo používaná metoda ozdravování rostlin. Ribavirin použili s úspěchem autoři Jakab-Ilyefalvi a Pamfil (2011) k ozdravení slivoní od šarky švestky (PPV). Jako nejvhodnější se osvědčila v jejich experimentech koncentrace ribavirinu 30 mg/l. Také Paunovic a kol. (2007) dospěli k podobným výsledkům. Při ozdravování odrůdy slivoně ´Čačanská Lepotica´ použili koncentrace ribavirinu 10, 20, 40, 60, 80 a100 mg/l. Při použití koncentrací ribavirinu 40 a 60 mg/l docházelo k ozdravení rostlin, koncentrace ribavirinu 10 a 20 mg/l uvádějí autoři jako zcela neúčinné k eliminaci PPV. Při použití koncentrací ribavirinu 80 a 100 mg/l, docházelo již k projevům fytotoxicity. Dále byl použit ribavirin v práci El-Dougdoug (2010) k ozdravení broskvoní od viroidu zakrslosti chmele (HSVd). Autoři doporučují koncentraci ribavirinu od 10 do 20 mg/l s následnou chladovou terapií.
Materiál a metodika
Cílem práce bylo ozdravení rostlin odrůd meruňky a broskvoně od hospodářsky významných virů, a to: viru chlorotické skvrnitosti jabloně, Apple chlorotic leafspot virus (ACLSV), viru nekrotické kroužkovitosti třešně, Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), viru zakrslosti slivoně, Prune dwarf virus (PDV) a viru šarky švestky, Plum pox virus (PPV). Pro účely ozdravování byly vybrány rostliny odrůd, které byly v roce 2005 uměle infikovány viry, a které byly testovány na přítomnost virů v roce 2009 metodami DAS-ELISA a RT-PCR s pozitivním výsledkem. Následující přehled uvádí seznam odrůd s vyznačením viru (virů) přítomného (přítomných) před procesem ozdravování. Odrůdy meruňky/patogeny přítomné před ozdravováním: ´Bergeron´/ PPV; ´Velkopavlovická´/ACLSV; ´Marlen´/ PDV, ACLSV. Odrůdy broskvoně/patogeny přítomné před ozdravováním: ´Suncrest´/ACLSV a ´Redhaven´/PNRSV. K založení kultur byly použity srpnové letorosty, rozdělené nůžkami na jedno-nodální segmenty. Tyto segmenty byly povrchově desinfikovány 0,2% roztokem chloridu rtuťnatého (HgCl2) po dobu pěti minut. Následně byly segmenty již ve sterilních podmínkách kultivačního boxu máčeny 3x ve sterilní destilované vodě a to vždy po deseti minutách. Od každé odrůdy bylo použito 40 kusů segmentů k pokusům s chemoterapií. Takto ošetřené segmenty byly zakráceny ve spodní části o 1 až 2 mm a poté byly umístěny do zkumavek s připraveným kultivačním médiem. Pro odrůdy meruňky bylo použito médium M1, pro odrůdy broskvoně médium B1 (tab. 1). Řádně označené zkumavky byly umístěny do kultivační komory, kde byla teplota 24 oC, fotoperioda 16/8 a světelná intenzita 25 μmol • m-2 • s-1. Prorůstající segmenty byly pasážovány vždy po čtyrech týdnech na čerstvé médium. Po třech měsících kultivace byl proveden pokus s chemoterapií. Rostliny byly pasážovány na médium M1 (případně B1) s přídavkem ribavirinu. Ribavirin byl do média přidáván v koncentracích: 0 mg/l (kontrola), 10 mg/l, 20 mg/l a 40 mg/l. Na médiu s ribavirinem byly rostliny kultivovány čtyři týdny a po té z nich byly odebrány vrcholové segmenty velikosti 3 mm. Regenerace segmentů probíhala dva měsíce. Po té byly rostliny přeneseny k zakořenění na médium M2 (v případě meruněk) nebo médium B2 (v případě odrůd broskvoně). Složení médií uvádí tabulka 1.
Použitá DAS-ELISA v našich experimentech byla provedena pomocí antisér fa. Bioreba. Použité pufry byly připraveny dle metodiky Bioreba. Byly použity lyofylizované pozitivní a negativní kontroly dodané k diagnostikům stejnou firmou a rovněž čerstvé pozitivní vzorky. Absorbance vzorků byla měřena při 405 nm.
Detekce virů ACLSV, PPV, PDV, PNRSV a vnitřní pozitivní kontroly rodu Prunus L. pomocí RT-PCR: Z rostlinného materiálu byla izolována celková RNA pomocí kitu SpectrumTM Plant Total RNA Kit (Sigma-Aldrich®). RNA byla následně ihned použita pro reverzní přepis, případně skladována při –80 °C.
Reverzní transkripce: K základnímu mixu 12,5 µl DEPC vody a 0,25 g náhodného primeru byly přidány 2 µl RNA, tento mix byl denaturován při 95 °C po dobu pěti minut. Následně byl přidán 1x RT pufr (Fermentas), 10mM dNTP (Invitek) a 200U M-MLV-RT (Fermentas). Vzorky byly vystaveny teplotě 42 °C po dobu šedesáti minut. Detekce virů ACLSV, ApMV, PPV, PDV, PNRSV a vnitřní pozitivní kontroly MDH (detekce tzv. houskeeping genu pro malát dehydrogenázu) pomocí PCR: Reakční PCR mix byl připraven z vody (HPLC čistota), 1x DNA pufr pro polymerázu (Finnzymes), 10mM dNTPs (Invitek), 1U DNA polymeráza (Finnzymes), 0,4 mM primery a 2 µl cDNA) komplementární DNA. Celkový objem PCR mixu byl 25 µl.
Celý text článku naleznete v tištěné verzi časopisu Zahradnictví č. 12/2011.
Text a foto Ing. Břetislav Křižan, Ph.D., Ing. Eva Ondrušiková, CSc., Ing. Jana Moudrá, Ing. Aleš Eichmeier, Ing. Věra Holleinová, Ph.D., Mendelova univerzit v Brně, ZF v Lednici
