Metoda mikropropagace česneku s využitím stonkových disků se prokázala jako velmi nadějná u japonského kultivaru ´Fukuchi – howaito´. V naší práci jsme tuto metodu aplikovali na krajové genotypy ‘Karel‘, ‘prostějovsko‘, ‘Rousínov 1‘ a ‘Dubový vrch – Zarosice‘ a na genotypy ‘Ropal‘, ‘Alan‘, ‘Moravan’ a ‘Prim‘. Z výše uvedených genotypů zareagoval na tuto metodu multiplikací krajový genotyp ‘prostějovsko‘ a ‘Dubový vrch – Zarosice‘ a genotyp ‘Alan‘. U ostatních testovaných genotypů jsme nezaznamenali významnou multiplikační reakci na tento způsob mikropropagace.
Summary
Garlic micropropagation using the stem–disc culture method proved to be very promising in Japanese garlic cultivar ´Fukuchi – howaito´. In our study we used this method for micropropagation of garlic landraces ‘Karel‘, ‘prostějovsko‘, ‘Rousínov 1‘ and ‘Dubový vrch – Zarosice‘ and genotypes ‘Ropal‘, ‘Alan‘, ‘Moravan‘ and ‘Prim‘. Landrace ‘prostějovsko‘ and ‘Dubový vrch – Zarosice‘ and genotype ‘Alan‘ responded to this method by multiplication. Other tested genotypes did not show multiplication response to this way of micropropagation.
Zvyšující se poptávku po kvalitním českém česneku se v České republice nedaří pěstitelům pokrýt. Zásadním problémem je nedostatek kvalitní zdravé sadby česneku. Šlechtěný česnek (Allium sativum L.) je sexuálně sterilní plodina a je výhradně rozmnožována vegetativně (Novák, 1990). Tento způsob rozmnožování je však charakterizován nízkým multiplikačním koeficientem a přenosem virů z mateřské rostliny, což podpořilo vývoj četných postupů množení česneku in vitro, jež vykazují vyšší multiplikační koeficient a eliminují riziko přenosu virů (Verbeek a kol., 1995). Způsoby multiplikace česneku lze rozdělit do dvou kategorií, a to na množení mechanickými zásahy a množení chemickou úpravou kultivačních a multiplikačních médií (Nagakubo a kol., 1993, Ayabe 1998, Luciani a kol., 2001). Jedním z nejslibnějších postupů s nejvyšším multiplikačním koeficientem je metoda využívající stonkových disků. Stonkový disk je tvořen zkráceným stonkem neboli podpučím nesoucím na vrcholu apikální meristém a v úžlabí zdužnatělých listů vyrůstající kolaterální pupeny, které mají potenciál vzniku nové rostliny. Ayabe a Sumi (1998) demonstrovali tuto metodu na japonském kultivaru ´Fukuchi – howaito´ a získali 20 až 30 výhonků diferencovaných z jednoho stroužku během jednoměsíční kultivace na Linsmaier–Skoog mediu bez fytohormonů. Ayabe a Sumi (1998) také zjistili, že vystavení česnekových palic chladu (4°C) na přibližně osm týdnů před preparací stonkového disku zlepšilo vývoj výhonků i tvorbu mikrocibulek.
Základním předpokladem pro získání a následné množení zdravého česneku in vitro je zdravý výchozí materiál, kde viruprostost hraje nejzásadnější, ale také nejobtížněji dosažitelnou roli. Viruprostých rostlin je možno docílit buď ozdravovacími procesy, mezi které patří izolace meristému, chemoterapie, termoterapie, příp. kombinace těchto metod (Novák 1990, Senula a kol., 2000, Conci a kol., 2005), nebo výběrem zdravých jedinců, což však představuje velký problém vzhledem ke zdravotnímu stavu česneku v rámci České republiky (Klukáčková a kol., 2007) i celosvětově (Takaichi a kol., 1998).
Materiál a metody
K pokusu, který proběhl v období červen 2009 až březen 2010, bylo použito 86 in vitro rostlinek česneku krajových genotypů ozdravených od virů OYDV, GCLV, LYSV a SLV. Všechny tyto genotypy mají původ v bývalém Československu nebo jeho nástupnických státech a významné jsou z hlediska originality, zachování biodiverzity a šlechtitelství. Do pokusu byly zahrnuty všechny tři morfotypy česneku. Paličák byl prezentován krajovými genotypy ‘Karel‘, ‘prostějovsko‘, ‘Rousínov 1‘ a ‘Dubový vrch – Zarosice‘ a genotypy ‘Ropal‘ a ‘Moravan‘. Nepaličák byl zastoupen genotypem ‘Prim‘ a přechodný typ genotypem ‘Alan‘.
Během kultivace byla u rostlinek indukována tvorba mikrocibulek zvýšením koncentrace sacharózy v médiu. Mikrocibulky byly na 8 až 10 týdnů uloženy do 4 – 8 °C a následně byly rozděleny na dvě poloviny (obr. 1). První polovina mikrocibulek představovala kontrolní skupinu (K), z druhé poloviny mikrocibulek představující skupinu D byly preparovány dva disky. První disk byl preparován v rovině předpokládaného apikálního meristému (disk s M) a druhý přímo pod ním (disk bez M). Síla disků byla asi 1 mm a každý disk byl ještě rozpůlen. Kontrolní polovina mikrocibulek i disky z mikrocibulek byly uloženy do zkumavek se šikmým agarem na Murashige–Skoog médium bez fytohormonů, příp. na petriho misky se stejným médiem. Zkumavky a petriho misky byly kultivovány při teplotě 22 – 24 °C a fotoperiodě 16 hodin světlo 8 hodin tma (obr. 2). Veškerá manipulace s mikrocibulkami byla prováděna v laminárním boxu s použitím sterilních nástrojů.
Výsledky a diskuze
Výsledky 60ti denní kultivace mikrocibulek a disků z mikrocibulek u jednotlivých genotypů uvádí tabulky 1 až 8. Počet životaschopných rostlin je dán počtem křížků a barevně jsou označeny mikrocibulky, u kterých došlo mechanickým zásahem k multiplikaci.
Ze 43 mikrocibulek kontrolní skupiny (K) vyrostlo po vyjmutí z chladničky a přenesení na Murashige–Skoog médium v životaschopnou rostlinu 32. Vitalita mikrocibulek byla tedy 74 %. Ze skupiny D bylo preparaci stonkových disků podrobeno 43 mikrocibulek. Z disků obsahujících meristém vyrostla ve 30 případech (70 %) aspoň jedna životaschopná rostlinka. Z disků pod předpokládaným meristémem vyrostla minimálně jedna životaschopná rostlinka v sedmi případech (16 %), což dokazuje přítomnost zkráceného stonku.
Z údajů které uvádí tab. 1 – 8 je patrné, že výsledky preparace dvou disků z každé mikrocibulky skupiny D můžeme rozdělit do čtyř skupin:
• první skupinu představují mikrocibulky, u nichž z každého z obou disků vyrostl minimálně jeden výhonek. Tato skupina dokazuje, že přítomnost apikálního meristému na disku není pro multiplikaci zásadní a že oba disky obsahovaly část zkráceného stonku. Tímto způsobem se rozmnožilo celkem šest mikrocibulek krajového genotypu ‘Dubový vrch – Zarosice‘ (tab. 4) a genotypu ‘Alan‘ (tab. 6) a ‘Prim‘ (tab. 8).,
• druhou skupinou jsou mikrocibulky, u nichž minimálně jeden výhonek vyrostl pouze ze svrchního disku, u kterého je předpoklad přítomnosti apikálního meristému. Tímto způsobem se multiplikovaly čtyři mikrocibulky krajového genotypu ‘Karel‘ (tab. 1) a ‘prostějovsko‘ (tab. 2). Důvodem, proč ze spodnějšího disku nevypučel ani jeden výhonek, může být absence zkráceného stonku nebo znehodnocení disku při preparaci.
• třetí skupina je v pokusu prezentována jednou mikrocibulkou genotypu ‘Alan‘ (tab. 6), kdy alespoň jeden výhonek vyrostl pouze ze spodnějšího disku, u něhož nebyl předpoklad apikálního meristému. Vysvětlením pro neživotnost svrchního disku může být chybná preparace disku, který neobsahoval zkrácený stonek, resp. zkrácený stonek se vyskytoval pod tímto vypreparovaným svrchním diskem, nebo byl tento disk během preparace znehodnocen.
• čtvrtou skupinu tvoří případy, kdy ani z jednoho disku nevyrostla ani jedna rostlina. Jednotlivé případy se vyskytly u všech genotypů kromě genotypu ‘Ropal‘, ‘Alan‘ a ‘Moravan‘. Důvodem pro toto neúspěšné množení je snížená vitalita mikrocibulek, znehodnocení disků během preparace, příp. nevhodnost množení některých genotypů touto metodou .
Případy multiplikace, kdy vyrůstá výhonek jak z disku s meristémem, tak ze spodnějšího disku, dokazují, že zkrácený stonek nesoucí kolaterální pupeny je vypouklý s meristémem na vrcholu (Havránek, 1972) a že oba vypreparované disky obsahují část tohoto zkráceného stonku. Míra konvexnosti je záležitost nejen genotypově specifickou, ale závisí také na vývojové fázi rostliny. Nelze tedy unifikovat sílu disku pro všechny genotypy a všechny vývojové fáze. Například Ayabe a Sumi (1998) uvádí ve své práci se stroužky česneku kultivaru ´Fukuchi – howaito´ sílu disku 1 mm, v našem pokusu se u mikrocibulek krajového genotypu ‘Dubový vrch – Zarosice‘ a genotypů ‘Alan‘ a ‘Prim‘ prokázalo jako efektivní síla disků 2 mm.
Celý text článku naleznete v tištěné verzi časopisu Zahradnictví 2/2012.
Text Mgr. Jana Krajíčková,
Foto autorka a Ing. Lenka Wasserbauerová, Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s. r. o.
