Cílem práce bylo ověřit nové přístupy k produkci ozdraveného množitelského materiálu jabloní s využitím moderní biotechnologické metody kryoprezervace v kapalném dusíku. Z výhonů jabloní Golden Delicious infikovaných virem chlorotické skvrnitosti listů (ACLSV) byly založeny in vitro kultury. Po namnožení byly vzrostné vrcholky explantátů zamrazeny vitrifikačními metodami, opětovně rozmrazeny a znovu vysazeny na živná média. V případě kapkové vitrifikace se v regenerovaných výhonech podařilo několikanásobně snížit koncentraci virových částic, v případě jednoduché vitrifikace již virus nebyl detekován vůbec. Dosažené výsledky prokazují potenciál kryoprezervace pro ozdravování vegetativně množených ovocných plodin v rámci certifikace zdravotního stavu výchozího množitelského materiálu.
Česká republika, resp. Ministerstvo zemědělství ve spolupráci s pracovišti zemědělského aplikovaného výzkumu, zavedla systém certifikace zdravotního stavu výsadbového materiálu ovocných dřevin a révy vinné, který je v souladu s doporučenými certifikačními schématy EPPO a závaznými předpisy Evropské unie (Anonym 1999). Tuzemská produkce školkařských výpěstků ovocných plodin je stabilizovaným, ekonomicky významným odvětvím rostlinné výroby s mírně rostoucím potenciálem. Školkařská výroba ozdraveného výchozího materiálu jádrovin má přitom v ovocnářsky vyspělých zemích prokazatelný přínos v konkurenceschopnosti pěstitelů a zajišťuje zvýšenou kvalitu plodů a výnosu. Jabloně jsou u nás dlouhodobě hospodářsky nejvýznamnější skupinou ovocných plodin. Na území České republiky bylo v roce 2022 evidováno 5864 hektarů produkčních výsadeb, což představuje téměř polovinu z celkové plochy produkčních ovocných sadů (Němcová a Buchtová 2022). Jabloně mohou být infikovány více viry současně. Virová onemocnění každoročně způsobují ve školkařském sektoru a u trvalých kultur významné hospodářské škody. Viry infikovaný materiál již nelze v polních podmínkách dodatečně ozdravit. V rámci projektu QK1910065 Národní agentury zemědělského výzkumu zabývajícím se novými přístupy k produkci ozdravených odrůd jabloní s využitím diagnostiky nové generace sekvenování (NGS) je cílem vypracování certifikované metodiky zaměřené na výzkum metod ozdravování pomocí chemoterapie, kryoterapie a explantátů v in vitro kulturách pro získání výchozího viruprostého množitelského materiálu pro systém certifikace zavedený v ČR. VŠÚO Holovousy s. r. o. se v minulém období zabýval zejména problematikou ozdravování odrůd ovocných dřevin pomocí termoterapie a chemoterapie s využitím konvenčního antivirotika ribavirin. Kryoterapie přitom představuje novou perspektivní možnost pro dosažení ozdravení od virových infekcí. Tato metoda tzv. kryonože je založena na faktu, že zatímco buňky meristematické oblasti jsou díky své stavbě často schopny po rozmrazení regenerovat, okolní pletiva zpravidla nepřežívají (Benson 2008). Pokud se patogen v meristematických buňkách nevyskytoval, získáme tímto postupem po regeneraci zdravý materiál.
Materiál a metody
Před zahájením ozdravování byla v rámci projektu QK1910065 zjišťována přítomnost virů ve vybraných stromech metodami RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) a NGS (New Generation Sequencing). Na pracovišti VŠÚO Holovousy bylo uskutečněno ozdravování pomocí kryoterapie s využitím in vitro kultur. In vitro kultury byly zakládány z dormantních výhonů prokazatelně nemocných jabloní odrůdy Golden Delicious narašených v laboratoři od února do dubna. Pupeny byly sterilizovány 0,15% HgCl2. Jako výchozí médium pro založení kultury a multiplikaci bylo používáno MS médium s mikroprvky a makroprvky podle Murashige a Skoog (1962), kyselinou indol-3-máselnou v koncentraci 0,1 mg/l a 6-benzylaminopurinem v koncentraci 1,5 mg/l. Teplota v kultivační místnosti byla nastavena na 22 °C, fotoperioda na 16 hodin světla a 8 hodin tmy.
Celý text článku naleznete v tištěné verzi časopisu Zahradnictví č. 12/2023.*
Text a foto: Ing. Jiří Sedlák, Ph.D., VŠÚO Holovousy, s. r. o.
