Ozdravování slivoní od viru šarky švestky pomocí in vitro kultur

Virus šarky švestky (Plum pox virus – PPV) se rozšířil po celé Evropě počátkem minulého století z Bulharka, kde byl poprvé popsán po první světové válce. Na celém území České republiky byl první výskyt zaznamenán ve 40. letech 20. století a velice rychle se rozšířil po celém našem území.

Problematika tohoto viru se týká především ovocných dřevin, meruněk, broskvoní a slivoní, jakožto významných hospodářských komodit, přičemž působí negativně na kvalitu plodů, obsah cukrů v plodech a výnos. Výskyt PPV byl registrován i na planých druzích rodu Prunus, které pak mohou sloužit jako rezervoáry viru. V České republice byl popsán výskyt tří kmenů viru šarky švestky; PPV-D, PPV-M a PPV-Rec; dokonce byl zjištěn i kmen viru, který infikuje třešně a višně. Boj proti virovým chorobám je velice obtížný, protože nelze působit přímo na virus. Pokud jsou známé, používáme odolné či tolerantní odrůdy a snažíme se odstranit rezervoáry viru. Přenašečem viru šarky švestky jsou všudypřítomné mšice, přenos je nepersistentní.

Eliminace viru pomocí chemoterapie
Pro systémy certifikace a k zachování genetické informace existujících kultivarů ovocných dřevin je třeba získat viruprosté matečné rostliny. Někdy je však obtížné či nemožné zajistit příslušný kultivar, proto je třeba znát možnosti eliminace viru šarky švestky například prostřednictvím chemoterapie in vitro kultur. Pěstování rostlin trvalých kultur metodou in vitro je významným přínosem pro eliminaci virů v ovocných dřevinách. Použitím in vitro kultur se významně zjednodušuje manipulace s ovocnými dřevinami a zvyšuje se i účinnost terapií, ať už se jedná o chemoterapii či termoterapii. Nicméně během termoterapie mnoho rostlin odumírá, a proto chemoterapie in vitro kultur může být přínosnou metodou pro získávání viruprostého rostlinného materiálu. Je třeba si uvědomit, že metody ozdravování jsou určeny pro získání rostlinného materiálu dále uchovávaného např. v technické izolaci. Volně v přírodě pochopitelně působí tlak ze strany přenašeče, čemuž i zdravý strom dlouhodobě jen těžko odolá.

Čtyři fáze procesu
Ráda bych vás seznámila s postupem chemoterapie na konkrétním příkladu slivoně ´Bluefree´ od nemocného stromu až po zdravého šlechtěnce. Proces, který se vám pokusím nastínit, berme z obecného nejjednoduššího hlediska. Celá metoda ozdravování pomocí chemoterapie je mnohem složitější, ale domnívám se, že pro utvoření představy, jak asi ozdravování probíhá, bude tato ukázka dostatečná.
Mějme poslední strom slivoně ´Bluefree´ na planetě, který je bohužel napaden virem šarky švestky. Chceme ovšem získat viruprostého jedince zmiňované slivoně například pro šlechtitelský proces nebo uchování matečné rostliny této slivoně atd.
Celý proces chemoterapie probíhá ve čtyřech hlavních fázích: v první fázi potřebujeme adaptovat slivoň na in vitro prostředí a vypěstovat dostatečné množství klonů, je pochopitelné, že v průběhu terapie může dojít ke ztrátám; v druhé fázi budeme pěstovat připravené klony na médiu s přídavkem virostatika (v našem případě ribavirinu); ve třetí fázi, po ukončení chemoterapie, necháme rostliny vytvořit základy kořenů; a konečně ve čtvrté fázi je převedeme z in vitro prostředí do substrátu. Nyní se podívejme na zmíněné fáze terapie podrobněji a ukažme na zásadní úskalí, která jsou v nich ukryta.
(boldovaně)
První fáze – adaptace na in vitro prostředí a příprava klonů pro terapii
Základem úspěchu je vhodné médium, v kterém budeme vybraný kultivar pěstovat. Pro slivoně je velice vhodné základní Murashige-Skoog médium doplněné o fytohormony, sacharózu, vitamíny a zpevňující látku agar. Připravené médium doporučuji rozlít po cca. 25 ml do erlenmayerových baněk, uzavřených hliníkovou fólií a hlavně sterilizovat autoklávováním. Veškerá další manipulace s médiem musí probíhat v laminárním boxu, kde je zajištěna sterilita pracovního prostředí. Pro převod do in vitro prostředí se nejlépe hodí mladé letorosty s vyvinutými pupeny. Sterilizaci rostlinného materiálu provádíme 20% savem s přídavkem smáčedla po dobu zhruba 15 minut, podle síly letorostů. Před pasážováním (sázením) do boxu třikrát řádně propláchneme rostlinný materiál sterilní destilovanou vodou. Je třeba zvolit dobu sterilizace tak, abychom zničili případné houbové či bakteriální patogeny, jenž by způsobily kontaminaci materiálu, ale zároveň nesmí dojít ke zničení vzrostného vrcholu pupenu. Je třeba být obezřetný při výběru letorostů. Doporučujeme výměnu média vždy po maximálně čtyřech týdnech. Díky vhodnému poměru auxinů a cytokininů v médiu získáme v průběhu následujících dvou až tří měsíců potřebné množství klonů, které nám zaručí, že odumírání rostlin při terapii neohrozí výsledek.
Druhá fáze – chemoterapie
V této fázi potřebujeme dostatečné množství klonů adaptované na in vitro prostředí. Dále připravíme médium s obsahem virostatika, v našem případě použijeme ribavirin. Částečně zde platí pravidlo, čím více ribavirinu, tím kratší doba ozdravování. Ale pozor, od cca. 40 mg/l se stává ribavirin pro rostliny fytotoxický. V našich pokusech jsme testovali tři různé koncentrace ribavirinu v médiu a v této fázi můžeme říci, že 10 mg/l média bylo 100% účinné při délce terapie 13 týdnů (± 2 týdny). Ribavirin se přidává přímo při přípravě média do roztoku. Je nutné dbát na výměnu média každé tři až čtyři týdny, abychom tak udrželi hladinu živných látek a ribavirinu. Chemoterapii ukončíme pasážováním rostlin do média bez přídavku ribavirinu. Po chemoterapii je třeba provést testování rostlinných vzorků sérologicky ELISA testem a molekulárně RT-PCR. Viruprosté rostliny nyní musíme převést z in vitro prostředí do substrátu. Než tak učiníme, uvědomme si, že rostliny na médiu v baňkách jsou bez kořenů (zjednodušuje to manipulaci s nimi). Rostliny do této chvíle kořeny nepotřebovali, protože veškeré potřebné živiny získávali z média přímo.
Třetí fáze – tvorba kořenů
Přimět rostliny v in vitro prostředí, aby začaly tvořit kořenový systém, když jej do teď nepotřebovaly, je chemický oříšek. V této chvíli připravíme poslední typ média. Opět vycházíme z Murashige-Skoog média, ale zásadně změníme poměr auxinů a cytokininů, vitamínů a chelátu železa. Přibližně za pět až devět týdnů se začnou objevovat základy kořenů. Někdy nám vyrostou přímo dlouhé, bíle silné kořeny, které jsou bez vlášení a tudíž pro rostlinu v substrátu nepoužitelné. Po převodu do substrátu rostlina tyto kořeny ztrácí a tvoří nové s kořenovým vlášením. Zde je nutno podotknout, že ochota tvořit základy kořenů je sezónní záležitost, především na jaře či na podzim. Ačkoliv se může zdát, že rostliny in vitro, uzavřené v kultivační místnosti s řízeným tepelným a světelným režimem konstantním po celý rok, nemůžou rozpoznat roční období, opak je pravdou.
Čtvrtá fáze – převod do substrátu
Ve třetí fázi jsme dokázali přesvědčit rostliny, aby vytvořily základy kořenů. Nyní nám zbývá poslední úskalí. Rostliny, které jsou zvyklé na nepřetržitý přísun dostatečného množství živin přímo z média do nadzemní části rostliny, šetrně přimět k tomu, aby si začaly obstarávat ze substrátu živiny samy a některé látky dokonce syntetizovaly. Navíc je zde stresující radikální změna prostředí, na jedné straně uzavřená skleněná baňka s minimální výměnou plynů s prostředím, navíc absolutně sterilní prostředí bez infekčního tlaku a na straně druhé nesterilní prostředí s výměnou plynů, infekčním tlakem a s poloviční vlhkostí vzduchu než v baňkách. Rostliny nejprve převedeme do rašelinových tablet umístěných v minipařeništi. Zálivku z počátku provádíme polovičním roztokem makro a mikroelementů základního média a hojně rosíme. Pro omezení stresujících faktorů tyto minipařeniště ponecháváme v kultivační místnosti, čímž zachováme teplotu a světelný režim, na který jsou rostliny zvyklé. Když rostliny zakoření a začnou regenerovat, je čas je převést do běžných skleníkových podmínek. I zde dochází při převodu k nezvládnutí stresujících změn a tedy ke ztrátám. Rostliny přesadíme z rašelinových tablet a kultivační místnosti do běžného zahradnického substrátu a minipařeniště umístíme do skleníku s řízenou teplotou a světelným režimem, postupně snižujeme umělou vlhkost a rostliny postupně odkrýváme, zalíváme vodou bez přídavku makro a mikroelementů, občas přihnojíme tekutým hnojivem.

Běh na dlouhou trať
Na závěr bych ráda dodala několik slov pro doplnění představy. Celý proces chemoterapie může trvat až tři roky, přičemž výsledkem je 15 – 20 cm vysoký šlechtěnec a v této době není započítán čas, který je třeba věnovat optimalizaci celé metody pro určitý kultivar či druh ovocné dřeviny. Bohužel se nám do dneška nepodařilo tuto metodu optimalizovat pro broskvoně, jenž velice neochotně regenerují v in vitro prostředí a jejich úmrtnost je v některých fázích stoprocentní. Naopak velice dobré zkušenosti máme se slivoněmi, které jsou dobře adaptabilní na in vitro prostředí.
Chemoterapie ovocných dřevin je vhodnou metodou pro eliminaci virů a získání viruprostého materiálu. Jak ukazují dosažené výsledky, tato metoda byť může být efektivní, je časově náročná. Viruprostý materiál může být využit pro biotechnologické postupy v rámci systému certifikace viruprostého výsadbového materiálu ovocných dřevin.

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *